質(zhì)粒菌株庫(kù)以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的各類載體構(gòu)建，如大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體、桿狀病毒表達(dá)載體、哺乳動(dòng)物表達(dá)載體；報(bào)告基因載體等。對(duì)于質(zhì)粒菌株庫(kù)中質(zhì)粒的提取可能會(huì)出現(xiàn)未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒提取率較低的現(xiàn)象，如何分析解決呢？
1.大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
2.質(zhì)粒拷貝數(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3.菌體中無(wú)質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
4.堿裂解不充分：使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
5.溶液使用不當(dāng)：溶液在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
6.吸附柱過(guò)載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。
7.質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí))：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
8.乙醇?xì)埩簦浩匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
9.洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)*覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。
10.洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過(guò)低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
11.洗脫體積太小：洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
12.洗脫時(shí)間過(guò)短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置1min可達(dá)到較好的效果。
更新時(shí)間：2021-07-21 
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